Perkusio, dar žinoma kaip kokliušas, yra itin užkrečiama kvėpavimo takų liga, kurią sukelia bakterija Bordetella pertussis. Šios ligos patogeniškumą daugiausia lemia išskiriami toksinai, tarp kurių išsiskiria kokliušo toksinas (PTx). PTx yra AB5 tipo egzotoksinas, sudarytas iš penkių baltymų subvienetų: S1, S2, S3, S4 ir S5. Pagrindinis jo poveikis organizmui yra susijęs su G-baltymų reguliuojamų signalų perdavimo kelių sutrikdymu, ypač slopinant adenilatciklazės veiklą ir didinant ciklinių adenozino monofosfato (cAMP) kiekius ląstelėse. Tai lemia daugybę sisteminių poveikių, įskaitant limfocitozę, hormonų gamybos pokyčius ir padidėjusį jautrumą histaminui. Šis straipsnis nagrinėja PTx poveikį G-baltyminiais baltymais besijaučiantiems baltymams, ypač sutelkiant dėmesį į NADPH oksidazės aktyvacijos mechanizmus ir imuninės sistemos atsaką, remiantis naujausiais tyrimais.
Bordetella Pertussis ir Kokliušo Toksinas (PTx)
Kokliušas yra liga, kuri, nepaisant plataus masto vakcinacijos, išlieka reikšminga visuomenės sveikatos problema visame pasaulyje. Bordetella pertussis yra pagrindinis ligos sukėlėjas, nors retkarčiais pasitaiko ir B. parapertussis, B. holmesii bei B. bronchiseptica infekcijos. Ligos perdavimas vyksta oro lašeliais, ypač per kosulį ir čiaudulį, todėl ji yra labai užkrečiama. Inkubacinis periodas trunka apie 8-10 dienų (iki 21 dienos), o liga pasireiškia trimis stadijomis: katarrine, paroksizmine ir konvalescencine.
Kokliušo toksinas (PTx) yra pagrindinis B. pertussis patogeniškumo veiksnys. Jis yra AB5 tipo egzotoksinas, kurio struktūrą sudaro viena aktyvioji A subvienybė (S1) ir penkios B subvienetys (S2, S3, S4, S5), atsakingos už prisijungimą prie ląstelės paviršiaus. A subvienytė turi ADP-riboziltransferazės aktyvumą. Ji katalizuoja NAD molekulės ADP-ribozilinimo pernešimą ant alfa subvieneto Gi baltymų šeimos. Gi baltymai yra svarbūs ląstelės signalų perdavimo tarpininkai, reguliuojantys daugelį biocheminių procesų, įskaitant adenilatciklazės aktyvumo slopinimą. Kai Gi alfa subvienetas yra ADP-ribozilinamas PTx, jis tampa neaktyvus, todėl nebėra slopinama adenilatciklazė. Tai lemia padidėjusią ciklinio AMP (cAMP) koncentraciją ląstelėje. Padidėjęs cAMP kiekis sukelia daugybę ląstelės disfunkcijų, įskaitant limfocitozę, insulino gamybos padidėjimą (sukeliantį hipoglikemiją) ir padidėjusį jautrumą histaminui, o tai gali lemti kapiliarų pralaidumo padidėjimą, hipotenziją ir šoką. PTx taip pat gali turėti ir Gi baltymams nepriklausomų poveikių.
NADPH Oksidazės Aktyvacijos Mechanizmai ir PTx Poveikis
Vienas iš svarbių PTx poveikių organizmui yra susijęs su NADPH oksidazės (NOX) aktyvacija. NOX yra fermentų šeima, atsakinga už superoksido anijono (O2-) gamybą, kuris yra svarbus fagocitų apsauginiame atsake prieš patogenus. Tačiau NOX fermentai taip pat dalyvauja įvairiuose ląstelės signalų perdavimo procesuose ir gali prisidėti prie uždegimo bei audinių pažeidimo.
Tyrimai su žmogaus IMR90 fibroblastais, kuriuose yra NADPH oksidazei panaši molekulinė mašina, parodė, kad N-formil-metionil-leucil-fenilalanino (N-fMLP) - stiprus fagocitų NADPH oksidazės aktyvatorius - stimuliacija sukelia:
- Greitą NADPH oksidazės aktyvaciją: Šią aktyvaciją galima slopinti superoksido dismutaze, o tai patvirtina superoksido gamybos padidėjimą.
- p47phox fosforilinimą ir translokaciją į membraną: p47phox yra svarbus citosolinis reguliacinis subvienetas, būtinas NADPH oksidazės aktyvacijai. Jo fosforilinimas ir prisijungimas prie ląstelės membranos yra esminis žingsnis, leidžiantis fermentui pradėti gaminti superoksidą.
Šie procesai yra susiję su ERK (extracellular signal-regulated kinases) kinazių aktyvacija. PD098059, MEK1 inhibitorius, slopinantis ERK aktyvaciją, visiškai užkerta kelią minėtiems reiškiniams, patvirtindamas ERK vaidmenį šiuose signalų perdavimo keliuose. N-fMLP stimuliacija IMR90 fibroblastuose sukelia greitą ERK1/2 fosforilinimą ir aktyvaciją, kurią taip pat slopina PD098059.
PTx poveikis NADPH Oksidazei ir ERK Aktyvacijai
Įdomu tai, kad IMR90 fibroblastų prieš tai apdorojimas kokliušo toksinu (PTx) prieš stimuliaciją N-fMLP, žymiai pakeičia ląstelės atsaką:
- ERK fosforilinimo slopinimas: PTx slopina formil-peptido sukeltą ERK fosforilinimą.
- NADPH oksidazės aktyvacijos prevencija: PTx neleidžia aktyvuotis NADPH oksidazei, kuri priklauso nuo NADPH.
- p47phox fosforilinimo ir translokacijos slopinimas: PTx slopina reguliacinio subvieneto p47phox fosforilinimą ir jo judėjimą į ląstelės membraną.
Šie rezultatai rodo, kad PTx gali blokuoti N-fMLP sukeltą NADPH oksidazės aktyvacijos signalų perdavimo kelią, kuris yra susijęs su Gi baltymų tarpininkaujamu ERK aktyvacijos slopinimu.
Formil-Peptidų Receptoriai ir Jų Vaidmuo
Tolesni tyrimai analizavo formil-peptidų receptorių (FPR ir FPRL1) ekspresiją IMR90 ląstelėse, naudojant RT-PCR. Paaiškėjo, kad šios ląstelės ekspresuoja tik mažo afiniteto FPRL1 receptorių, kuris, kaip žinoma, stipriau reaguoja į heksapeptidą WKYMVm (toliau - W peptidas) nei į N-fMLP.
Receptorių prisijungimo tyrimai su joduotu WKYMVm patvirtino specifinį W peptido prisijungimą prie FPRL1. Nustatyta, kad IMR90 ląstelių membranoje yra W peptido prisijungimo vietų, kurios specifiškai konkuruoja su nepažymėtu peptidu. Remiantis šiais duomenimis, prognozuojama disociacijos konstanta yra 160 nM, o receptorių tankis - apie 16200 molekulių/ląstelę.
Kadangi FPRL1 yra biologiškai aktyvus, jo genas buvo klonuotas į eukariotinį ekspresijos vektorių ir transfekuotas į HEK293 ląsteles. Šios ląstelės, kuriose ekspresuojamas NOX4 (ne fagocitinis NADPH oksidazės narys), bet ne formil-peptidų receptoriai, buvo stimuliuojamos N-fMLP arba WKYMVm.
Polimorfonuklearinėse ląstelėse formil-peptidų sąveika su Gi baltymų prijungtais receptoriais aktyvuoja fosfolipazę Cβ, kuri generuoja inozitolio 1,4,5-trifosfatą ir diacilglicerolį. Šie signalų nešikliai vėliau gali aktyvuoti proteinus kinazes C (PKC).
Proteinų Kinazių C (PKC) Vaidmuo NADPH Oksidazės Aktyvacijoje
Buvo tiriamas PKC vaidmuo ne fagocitinės NADPH oksidazės aktyvacijoje IMR90 ląstelėse, naudojant specifinius įvairių PKC izoformų inhibitorius (Go6983, Go6976, GF109203X ir rottleriną). Aktyvacijos tyrimai parodė, kad W peptido stimuliacija šiuose fibroblastuose sukelia PKC substrato fosforilinimą priklausomai nuo dozės.
Kadangi aktyvuota PKC daugelyje ląstelių tipų stimuliuoja ERK, Ras ir Raf kinazes, pirmiausia buvo įvertintas šios kinazės vaidmuo ERK aktyvacijoje IMR90 ląstelėse, inkubuojant su W peptidu. Vėliau buvo analizuojama šių inhibitorių geba užkirsti kelią NADPH oksidazės aktyvacijai.
Rezultatai parodė, kad rottlerinas, Go6976 ir GF109203X slopina p47phox fosforilinimą ir translokaciją į membraną. Atitinkamai, fermentų aktyvacijos tyrimai, atlikti su membranos ir citoplazmos frakcijomis, NADPH, FAD ir feri-citichromo c buvimui, parodė, kad šie inhibitoriai taip pat užkerta kelią citichromo c redukcijai superoksido anijono, generuojamo W peptido aktyvuotos NADPH oksidazės, veikimu.
PKC delta Izoformės Aktyvacija
Western blot analizė, siekiant identifikuoti W peptido aktyvuotas PKC izoformas, dalyvaujančias ne fagocitinės oksidazės aktyvacijos procese, parodė, kad būtent PKC delta, o ne kitos izoformos, aktyvuojasi, transliuodama į membraną po 2 minučių inkubacijos su W peptidu. Jos aktyvacija yra būtina visavertei NADPH oksidazės funkcijai.
Šie atradimai pabrėžia sudėtingą PTx poveikio signalų perdavimo kelius, įtraukiant G-baltymus, ERK kinazes, formil-peptidų receptorius ir PKC delta. Šių mechanizmų supratimas yra svarbus ne tik pagrindiniams biologiniams procesams, bet ir kokliušo patogenezės bei galimų terapinių intervencijų kūrimui.
Kokliušo Diagnostika ir Gydymas
Nors šis straipsnis daugiausia dėmesio skiria PTx poveikiui ląsteliniams mechanizmams, svarbu paminėti ir kokliušo diagnostikos bei gydymo aspektus, kurie yra glaudžiai susiję su ligos supratimu.
Diagnostika
Kokliušo diagnostika remiasi klinikiniais simptomais, tačiau galutinį patvirtinimą suteikia laboratoriniai tyrimai. Pagrindiniai metodai apima:
- Bakteriologinis pasėlis: Nosiaryklės tepinėlio pasėlis ant specialaus agaro terpės. Šis metodas yra patikimas, bet reikalauja ilgo inkubavimo laiko (iki 10 dienų) ir yra jautresnis antibiotikų terapijai.
- Molekuliniai tyrimai (PCR): Greitas ir jautrus metodas, aptinkantis B. pertussis DNR. Jis gali būti atliekamas nuo simptomų pradžios iki 3-4 savaičių. PCR yra pirmo pasirinkimo metodas, ypač per pirmuosius 4 ligos savaites.
- Serologiniai tyrimai: Nustatomi antikūnai prieš B. pertussis (IgG, IgA, IgM). Šie tyrimai nėra tinkami ūmios infekcijos nustatymui, nes imuninis atsakymas yra vėluojantis, tačiau gali būti naudingi praėjus 2-8 savaitėms po simptomų pradžios, ypač neaiškiais atvejais ar epidemijų metu. Reikėtų vengti IgM tyrimų dėl jų mažo jautrumo.
Gydymas
Kokliušas gydomas antibiotikais, dažniausiai makrolidų grupės (eritromicinas, azitromicinas, klaritromicinas). Antibiotikai yra efektyviausi, jei pradedami katarrinėje stadijoje, siekiant palengvinti ligos eigą ir sumažinti užkrečiamumą. Vėlesnėse stadijose antibiotikai mažiau veikia simptomus, bet vis tiek rekomenduojami siekiant apriboti ligos plitimą.
Svarbu paminėti, kad sunkiais atvejais, ypač naujagimiams, gali prireikti hospitalizacijos, deguonies terapijos, o kartais ir intervencijų, tokių kaip tracheostomija ar intubacija.
Prevencija ir Vakcinacija
Vakcinacija yra pagrindinė priemonė kokliušo prevencijai. Vaikams skiriamas kombinuotas difterijos, stabligės, kokliušo, poliomielito ir Haemophilus influenzae tipo b (Hib) vakcinas. Suaugusiems ir nėščiosioms rekomenduojamos atnaujinamosios vakcinos.
- Vakcinacija nėštumo metu: Viena iš svarbiausių strategijų yra nėščių moterų vakcinacija trečiąjį nėštumo trimestrą. Tai leidžia perduoti antikūnus vaisiui per placentą, suteikiant jam apsaugą pirmaisiais gyvenimo mėnesiais, kol jis dar nėra visiškai apsaugotas nuo vakcinacijos.
- "Kūko" (Cocoon) strategija: Ši strategija apima ne tik nėščių moterų vakcinaciją, bet ir artimiausių naujagimio kontaktų (šeimos narių) vakcinaciją.
Imunitetas po natūralios infekcijos ar vakcinacijos nėra ilgalaikis, todėl svarbu laikytis rekomenduojamų revakcinacijos schemų. Tai ypač svarbu siekiant apsaugoti jautriausias grupes - kūdikius iki 1 metų amžiaus, kurie yra labiausiai pažeidžiami sunkių kokliušo formų ir mirčių.
Pagal naujausius duomenis, PTx jautrių G-baltyminiai baltymai ir jų sąveika su fermentais, tokiais kaip NADPH oksidazė, atveria naujas perspektyvas suprasti kokliušo patogenezę. Šių molekulinių mechanizmų detalus ištyrimas gali padėti ne tik geriau suprasti ligos eigą, bet ir sukurti naujus diagnostinius bei terapinius metodus kovojant su šia vis dar aktualia infekcine liga.